Kinase Inhibitors
Der Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor-1 Rezeptor (IGF-1R) und der Insulinrezeptor (IR) sind Mitglieder der transmembranständigen Rezeptortyrosinkinasen, die zur Überfamilie der Wachstumsfaktorrezeptoren gehören. IGF-1R ist verantwortlich für die Entwicklung, normales Wachstum und Differenzierung der Zelle aber auch die Unterdrückung der Apoptose. Die Fähigkeit des Rezeptors, gleichzeitig proliferative und anti-apoptotische Signale zu initiieren, ihn zu einem möglichen Target für die Entwicklung von Inhibitoren als Krebs-Therapeutika. Die gängigen Kinaseinhibitoren sind niedermolekulare, ATP-kompetitive Inhibitoren. Da die ATP-Bindestelle unter Kinasen hoch konserviert ist, weisen solche Inhibitoren meist geringe Spezifität auf, was zu starken Nebenwirkungen führen kann. Besonders beim IGF-1R ist eine spezifische Inhibition essentiell. Eine gleichzeitige Hemmung des nah verwandten IR kann fatale Konsequenzen haben, wie zum Beispiel die Ausbildung eines diabetischen Phänotyps. Um dies zu umgehen, war es das Ziel dieser Arbeit, einen spezifischen, peptidischen Inhibitor für die Kinase des IGF-1R zu entwickeln. Nach übereinstimmender Meinung werden Rezeptortyrosinkinasen über Dimerisierung aktiviert. Daher basierte mein Ansatz zur Inhibition des IGF-R auf der Unterbindung der Dimerisierung über Kompetition mit sequenzspezifischen Peptiden. Realisiert wurde dieses Konzept an zwei Bereichen des IGF-1R: Einmal der Juxtamembranbereich, in dem neben einer autoregulatorischen Region auch eine Dimerisierungsdomäne lokalisiert ist. Zudem unterscheiden sich IR und IGF-1R in dieser Region deutlich in ihrer Sequenz. Zum anderen die αD-Helix/hinge region, die maßgeblich den Konformationsübergang zwischen inaktiver und aktiver Kinasestruktur bestimmt und an der Dimerisierung der Kinase und der Substraterkennung beteiligt ist. Mittels Phage Display wurden aus einer nahezu unbeschränkten Anzahl an verschiedenen Peptiden mit randomerisierter Sequenz diejenigen selektioniert, die spezifisch an die entsprechenden Bereiche, Juxtamembranbereich und αD-Helix/hinge region, banden. Um die aus dem Phage Display erhaltenen Peptidsequenzen zu generieren wurde eine Technik entwickelt, kleine Peptide in E.coli im großen Maßstab zu expremieren und über Affinitätschromatographie zu reinigen.
Die Validierung der gefundenen Sequenzen gegen die Juxtamembrandomäne lieferte eine Peptidsequenz, die im µM Bereich fähig ist, die IGF-Kinase zu inhibieren:
• Die Substrat- und Autophosphorylierung der monomeren IGF-Kinase wird signifikant von dem Peptid gehemmt.
• Die inhibitorische Wirkung des Peptids ist sehr spezifisch für die Kinase des IGF-1R. Selbst die Kinase des nah verwandten IR wird von dem Peptid nicht gehemmt.
• Die Inhibition folgt einem nicht-ATP-kompetitiven Mechanismus.
• Die Aktivität der dimeren Kinase wird nicht beeinflusst. Das Peptid bindet gezielt die inaktive Kinase und verhindert den Dimerisierungsprozess.
• Zusätzlich entkoppelt das Peptid die Interaktion der Kinase mit der Phosphotyrosin-bindenden Domäne (PTB) des Insulinrezeptorsubstrtat-1 (IRS-1) und stellt somit einen Inhibitor der Signalweiterleitung dar. Diese Inhibition ist unabhängig von der Kinasestruktur.
Das Phage Display gegen das Peptid aus der αD-Helix/hinge region des IGF-1R lieferte eine Peptidsequenz, deren inhibitorische Wirkung deutlich stärker war als die des Peptids gegen die Juxtamembranregion:
• Das Peptid hemmt gezielt die monomere Kinase des IGF-1R; auf die dimere Kinase hat es keinen Einfluss.
• Durch die Bindung des Peptids an die hinge region wird die Kinase in ihrer autoinhibierten Konformation fixiert.
• Das Peptid inhibiert spezifisch nur die Mitglieder der Insulinrezeptorfamilie. Es bindet aber deutlich stärker an die Kinase des IGF-1R als an die IR-Kinase.
• Das Peptid inhibiert nicht-ATP kompetitiv.
Somit konnten in dieser Arbeit zwei Peptidinhibitoren generiert werden, die an zwei unterschiedliche regulatorische Bereiche der inaktiven Kinasestruktur binden und den Aktivierungsprozess der Kinase hemmen. Zusätzlich inhibiert eines der Peptide die Signalweiterleitung der Kinasen unabhängig von ihrer Struktur.
