Kinase Inhibitors
 
Der Insulinrezeptor ist ein Mitglied der Rezeptortyrosinkinasen und wird als solcher über produktive Dimerisierung und Autophosphorylierung des Rezeptors aktiviert, wobei es in Folge der Hormonbindung zur Annäherung der cytoplasmatischen Kinasedomänen kommt. In der Literatur wird für die Autophosphorylierung des Tyrosin 9601 (Y960) im Juxtamembranbereich der löslichen Insulinrezeptorkinase ein „cis“-Mechanismus –innerhalb einer Kinaseuntereinheit- und für die Autophosphorylierung in der Aktivierungsschleife und im C-Terminus ein „trans“-Mechanismus –zwischen zwei Kinaseuntereinheiten- beschrieben (Cann und Kohanski, 1997). Allerdings konnte unsere Arbeitsgruppe zeigen, dass die Autophosphorylierung der drei intrazellulären Domänen des Holorezeptors mit der gleichen Geschwindigkeit erfolgt (Kayatz, Diplomarbeit 1994). So ist anzunehmen, dass die Phosphorylierung dieser Domänen einem vergleichbaren Mechanismus folgt. Während die Phosphorylierung der Tyrosine in der Aktivierungsschleife zur Stabilisierung der Kinase dient, wird dem Y960 die entscheidende Rolle als Bindungsstelle (docking site) für die Substrate des IR (Bsp. IRS1) zugesprochen (Eck et al., 1996). In der vorliegenden Arbeit habe ich den Mechanismus der Autophosphorylierung an Y960 der monomeren, löslichen, C- terminal verkürzten Insulinrezeptorkinase untersucht. Dazu wurde eine inaktive Mutante dieser Kinasevariante (IRKD∆72Cmut) kloniert, expremiert und gereinigt. In der Kinase ist die invariante katalytische Base Aspartat 1120 (D1120) gegen Alanin mutiert. Die Substitution wurde auf DNA Ebene bestätigt und auf Proteinebene zeigt die mutierte Kinase wie erwartet keine Aktivität. Wird die inaktive Kinase in einer Substratphosphorylierung katalysiert durch die an GST fusionierte, dimere, aktive Insulinrezeptorkinase (GST-IRKD) phosphoryliert, so zeigt sie nicht nur den gleichen Phosphateinbau wie die Wildtyp-Kinase, sondern auch im nativen Gel die gleichen fünf Phosphorylierungsstufen, die das Y960 einschließen. Somit werden in der inaktiven Kinase als Substrat alle Phosphorylierungsstellen in „trans“ besetzt und lassen Zweifel auf eine „cis“-Phosphorylierung in der Wildtyp-Kinase aufkommen.    Des Weiteren wurde ein Derivat der Phosphotyrosin bindenden Domäne  (PTB-Domäne) des IRS1, welches N-terminal einen GST-Tag und C-terminal einen His-Tag besitzt (GST-PTB- His), kloniert, expremiert und gereinigt. Durch die Untersuchung der Wechselwirkung zwischen verschiedenen PTB-Konstrukten und dem phosphorylierten, an GST fusionierten Juxtamembranbereich des IGF-1Rezeptors (GST-IGF-NT), welcher radioaktiv markiert war, konnte eine Interaktion zwischen dem phosphorylierten GST-IGF-NT und der PTB-Domäne nachgewiesen werden.
Im zweiten Teil der Arbeit standen die Untersuchungen der Substratphosphorylierung von Proteinen, die zusätzlich zur Phosphorylierungsstelle eine SH2-Domäne als Phosphotyrosin bindende Einheit besaßen, im Vordergrund.  Als Substrat diente ein Fusionsprotein aus der SH2-Domäne (der N-terminalen, regulatorischen p85-Untereinheit der PI3-Kinase) und dem p30-Fragment von IRS1, das C-terminal mit der SH2-Domäne  verbunden war (SH2-IRS1CT). Außerdem wurde ein Fusionsprotein aus der gleichen SH2-Domäne und dem C-Terminus des IR (SH2-IRCT) generiert. Unsere Arbeitsgruppe konnte mit der PTB-Domäne als Adapterprotein zeigen, dass die Spezifität der Kinase (ob Tyrosin- und/oder Serin/Threonin- Phosphorylierung) in Bezug auf Substratphosphorylierung von der Komplexbildung mit dem Substrat abhängt (Karau, Diplomarbeit 2004). Julia Wassermann beobachtete in ihrer Diplomarbeit (2004) die Phosphorylierung des SH2-IRS1CT durch die IRKD∆72CWT, die bis zu 20 % Phosphoserin enthielt. Für den SH2-IRCT konnte sie jedoch keine Serinphosphorylierung nachweisen. Die Überprüfung durch meine Untersuchungen ergab folgende Ergebnisse für die Phosphorylierung der Substrate durch die IRKD∆72CWT:
• Im Falle des SH2-IRCT konnte gezeigt werden, dass der Phosphateinbau unabhängig von der Substratkonzentration war, das heißt es kam zu einem 1:1 Komplex zwischen Kinase und Substrat.
• Die Inititalgeschwindigkeit des Phosphattransfers war im Falle des SH2-IRCT unabhängig von der Substratkonzentration.
• Im Gegensatz dazu unterliegt der Phosphateinbau beim SH2-IRS1CT einer Konzentrationsabhängigkeit von Substrat im Bereich von 0,5 bis 5 µM Substrat.  
• Eine Phosphoaminosäureanalyse der phosphorylierten Substrate führte zu dem Ergebnis, dass der SH2-IRCT > 20 % Serinphosphorylierung aufwies, wohingegen der SH2-IRS1CT nur marginal an Serinresten phosphoryliert wurde. Im Gegensatz zur beobachteten dualen Phosphorylierung des SH2-IRCT mit der C-terminal verkürzten Kinase, konnte bei einer Phosphorylierung durch die N-terminal und C-terminal verkürzten Kinase (IRKD∆N∆C) keine Serinphosphorylierung gefunden werden. Das deutet auf eine Stabilisierung der Aktivierungsschleife durch den N-Terminus hin.