Forschungsprojekte

Befunde aus den 90er Jahren haben schon gezeigt, dass insbesondere neuronales Gewebe reich an O-mannosylierten Proteinen ist. Auch die schweren neurologischen Ausfallserscheinungen, welche bei Defektmutationen in O-Mannosyltransferasen auftreten weisen dieser Modifikation eine wichtige Funktion zu und lassen die Existenz weiterer O-mannosylierter Proteine vermuten.

Weitere O-mannosylierte Proteine werden mit zwei sich ergänzenden Strategien identifiziert. Mit der Azidozucker-Strategie wird 2-Azido-Mannose metabolisch in das Glykoproteom einer Zelle eingebaut. Die so modifizierten Glykoproteine werden nach Reaktion der Azidogruppe mit Alkin-modifiziertem Biotin affinitätschromatographisch angereichert und massenspektrometrisch identifiziert.

Um auch seltene O-mannosylierte Proteinspecies zu identifizieren ist eine alternative Proteom-Strategie geplant, welche auf einer neu etablierten in-Gel-Glykomik basiert. Gelelektrophoretische Fraktionen eines Maushirnlysates werden damit auf die Anwesenheit O-Mannose-basierender Glykane ausgemessen. Die Proteine positiv getesteter Fraktionen werden gelelektrophoretisch subfraktioniert und massenspektrometrisch identifiziert. Eine neu entwickelten chemische de-O-Glykosylierung auf einer Säule ermöglicht dabei eine Identifikation der hoch glykosylierten Protein- bzw. Peptidspezies.
  

Abbildung 1: Die de-O-Glykolsylierung basiert auf der zyklisch wiederholten, milden Oxidation immobilisierter asialo-O-Glykoproteine mit verdünntem Perjodat, gefolgt von einer Behandlung mit wässrigem Ammoniak.

Das Verfahren ist damit empfindlich genug, um O-Glykoproteine unter einem Mikrogramm hinsichtlich ihres O-Glykoprofils vollständig zu charakterisieren. In Vorversuchen konnten ausgehend von Extrakten aus Mäusehirn, deren gesamtes Protein in einer 5-10 mm-breiten SDS-Gelzone konzentriert vorlag, große Mengen O-Mannose-basierender Glykane in den betreffenden Präparaten nachgewiesen werden.



Abbildung 2: ESI-MS Spektrum der permethylierten Glykane des Maushirn-Proteoms (Christina Aust). Die rot markierten Signale stammen von Mannose-basierenden Strukturen.



Abbildung 3: ESI-MS/MS-Fragmentierungsmuster des Signals bei m/z 1099 (Christina Aust).