Funktionelle Analyse

Der Organismus

Dictyostelium discoideum, eine im Waldboden lebenden Amöbe, ist ein hervorragend geeigneter Organismus für das Studium der molekularen Mechanismen bei der Zelldifferenzierung, Signaltransduktion, Phagozytose, Zytokinese, Chemotaxis und Zellbewegung. Viele dieser Prozesse entsprechen denen in Säugetierzellen und die mit ihnen im Zusammenhang stehenden Gene können leicht mittels "targeted homologous recombination" inaktiviert werden. Somit ist Dictyostelium hervorragend geeignet für i) die genomweite Analyse differentiell regulierter Gene, gefolgt von ii) weiteren Analysen mit Hilfe der zur Verfügung stehenden Techniken der Molekularbiologie.

DNA Microarray

Eine Vielzahl von Genom- und EST-Projekten für verschiedene Organismen erzeugen riesige und exponentiell wachsende DNA-Sequenzdaten, die allen Forschern zur Verfügung stehen. Die vollständige Genomsequenz eines Organismus ist dabei nur der Anfang einer langen Reise zum Verstehen der Funktionen aller Gene des betreffenden Organismus. Neue Werkzeuge wie "DNA Microarrays" haben die Molekularbiologie revolutioniert, da sie die gesamte zur Verfügung stehende Sequenzinformation nutzen können. Mit Hilfe des hochparallelen Ansatzes der "DNA Microarrays" können wir versuchen, die komplexen Regulationsnetzwerke eines lebenden Organismus zu verstehen. Der Prozess zur Erzeugung eines DNA Microarrays für das gesamte Genom eines Organismus umfasst die Auswahl und Produktion von tausenden DNA-Proben. Für gespottete DNA Microarrays werden die Proben üblicherweise mit Hilfe der Polymerase Kettenreaktion (PCR) synthetisiert.

Das D. discoideum Microarray

Die 2005 beendete Dictyostelium Genom- und cDNA-Projekte in Deutschland (Institut für Biochemie I Köln in Zusammenarbeit mit dem Genome Sequencing Centre Jena), Grossbritanien (Sanger Institute), den USA (Baylor College of Medicine) und Japan (Tsukuba University) haben den Weg für die Erszeugung eines Dictyostelium DNA Microarrays geebnet. Das 34 Mb grosse Genom dieses Organismus ist verteilt auf sechs Chromosomen und die Anzahl der Gene wird auf 12.000 geschätzt.

Das gegenwärtige Dictyostelium DNA Microarray enthält die partiellen Sequenzen von etwa 450 bekannten Genen, 5.400 nicht redundanten ESTs des Dictyostelium cDNA Projekts und geeignete positive und negative Kontrollen. Wir befinden uns in der Phase der Inkorporierung der ca. 4.600 Gene der Chromosomen 1 und 2.

Wir nutzen dieses Werkzeug zum Studium der genomweiten Genexpressionsmuster von Dictyostelium-Zellen. Die Experimente werden mit molekulargenetischen und zellbiologischen Ansätzen ergänzt, um die Ergebnisse zu verifizieren und um die interessantesten der differentiell regulierten Gene in weiteren Einzelheiten zu studieren. Drei Hauptprojekte werden verfolgt:

• Transkriptionelle Regulation in Antwort auf Umweltänderungen, insbesondere der hyper- und hypoosmotischen Bedingungen.
• Transkriptionelle Veränderungen während der Aufnahme und Vermehrung von pathogenen Bakterien.
• Analyse der transkriptionellen Regulation in verschiedenen Mutanten im Vergleich zu Wildtyp-Zellen.